PTP1b 抑制剂检测 |生物测定系统

来自 : 发布时间：2024-05-14

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PTP1b 滴定为了确定用于 IC50 测定的 PTP1b 的适当量，我们滴定了每个 PTP1b。全长 PTP1b 从 75 ng/rxn 开始滴定，截短的 PTP1b 从 200 ng/rxn 开始滴定。两次滴定均使用 5 mM pNPP 作为底物进行。在 384 孔板中进行全长 PTP1b 滴定，以最大化吸光度信号。 （由于重复之间存在很大差异，我们决定改用 96 孔板进行 IC50 分析和所有截短的 PTP1b 分析。）

根据这些结果，我们选择对全长 PTP1b 使用 50 ng/rxn，对全长 PTP1b 使用 40 ng/rxn截短的 PTP1b。在这些浓度下，反应将保持线性至少 1 小时，并且 ΔOD 应显着即使在 pNPP Km 下，ficant (>0.2)。DMSO 滴定为了确定每个 PTP1b 对 DMSO 的耐受性，我们对每个 PTP1b 进行 DMSO 滴定（全长 PTP1b 从 0–27 v% 以及从 0-15 v% % 为截断的 PTP1b)。

对于这些滴定，我们对全长 PTP1b 和 40 每个反应使用 50 ng ng 截短的 PTP1b。通过添加 5 mM pNPP 启动反应，并允许进行 60 分钟。然后我们计算每个 DMSO 浓度的 ΔOD (OD60min – OD0min)，它与反应速率成正比。然后将 OD 与 DMSO 浓度作图。从这些结果中，我们发现 DMSO 实际上将每个 PTP1b 的活性增强到一定浓度。对于全长 PTP1b，我们决定继续使用 15 v% DMSO，对于截短的 PTP1b，我们决定使用 7.5 v% DMSO.Km 的 pNPP为了确定 PTP1b 的 pNPP 的 Km，我们用 50 ng 全长 PTP1b 或 40 ng 截短的 PTP1b 从 0–20 mM 滴定 pNPP，并计算 ΔOD (OD60min – OD0min ），对于每个 pNPP 浓度，它与反应速率成正比。ΔOD 为然后绘制与 pNPP 的关系图，并使用 Prism 4 (GraphPad Software Inc.) 计算 Km。全长 PTP1b Km 测定是在 15 v% DMSO 存在下进行的，截短 PTP1b Km 测定是在 7.5 v% DMSO 存在下进行的。我们发现全长 PTP1b 的 Km = 0.7 ± 0.04 mM，截短 PTP1b 的 Km = 1.3 ± 0.1 mM。

钒酸钠 Na3VO4 IC50 测定 IC50 测定需要两个步骤： 1) 25 µL PTP1b（50 ng 全长 PTP1b 或 40 ng 截短片段）预孵育 30 分钟PTP1b) 与 15 µL Na3VO4（全长 PTP1b 溶于 100% DMSO，截短 PTP1b 溶于 50 v% DMSO），2) 与 60 µL pNPP（全长 PTP1b 为 0.7 mM 最终 [pNPP]，最终为 1 mM [pNPP]）进行磷酸酶反应pNPP] 截断的 PTP1b) 60 分钟。我们从 0-1000 µM 滴定 Na3VO4，并计算每个 Na3VO4 浓度的 ΔOD。然后绘制 ΔOD 与 Log [Na3VO4] 的关系图，并使用 Prism 4 (GraphPad) 计算 IC50 Software Inc.）。我们观察到全长 PTP1b 的 IC50 = 19.3 ± 1.1 µM，截短 PTP1b 的 IC50 = 54.5 ± 1.1 µM。请发送电子邮件或致电 1-510-782-9988 x 2 请求检测服务。客户评价\" BioAssay Systems 了解他们的科学！我必须为我们公司开发一种生物测定法，罗伯特很快做出回应，让我们了解最新情况。他们知识渊博，足智多谋。他们向我们推荐了一家大宗供应商，该供应商可以为我们的活性成分提供非常优惠的价格。他们为我们的研究需要保留了非常详细的记录。我建议在您的检测开发项目中使用 BioAssay Systems！\"Anh-Dung LeCEO DermaTec LLC\"很高兴与 BioAssay Systems 合作。我将样品带到了他们的海沃德地点，并在不到 24 小时内收到了结果。与 Robert Z 的讨论是礼貌、开放且知识渊博的。罗伯特拥有斯坦福大学博士学位。此外，首席执行官 Frank Huang 也有足够的科学好奇心来尝试我们的清洁剂并提供反馈！这超出了客户关系的范围。 BioAssay Systems 是一家拥有丰富专业知识和友好、反应灵敏的问题解决方法的公司。我将热情地继续与他们合作开展我们的研究。\"Edward T. WeiOrinda Pharma, Inc. 首席科学官\"我要向 Bioassay Systems 服务团队表示感谢。我们正在开发一种使用荧光显微镜测量单细胞样品乳酸浓度变化的测定方法。 BioAssay Systems 团队在帮助我们优化其荧光 L-乳酸检测试剂盒以适应我们独特的实验设置方面提供了很大帮助。 BioAssay Systems 团队始终友好且知识渊博。我们知道我们可以依靠他们提供快速、专业的服务副。\"Paul Abbyad 博士，圣克拉拉大学助理教授\"在开发用于药物洗脱支架的可生物降解涂层时，我与 Bob 合作开发一种准确、精确和灵敏的测定方法来确定组织中残留的聚合物量。很高兴与鲍勃和他的团队合作，他们非常彻底，他们非常了解科学，并且总是以合适的价格按时交付。我强烈推荐任何人e 将来使用 BioAssay Systems 服务。\"Patrick H. Ruane博士，主任化学 XTENT, Inc.上一页下一页